2019年10月（yuè）1日（rì），5-羟甲（jiǎ）基化胞（bāo）嘧（mì）啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖（táng）尿病研究领域取得重要进展。2型糖尿（niào）病（T2D）的血管并发（fā）症是导致2型（xíng）糖尿病致残致死的（de）重（chóng）要（yào）病因，一直（zhí）缺乏一（yī）种无创便捷的临（lín）床途径实现血（xuè）管并发症的（de）发生发展监测，达（dá）到早发现、早干预，以提（tí）高（gāo）T2D病人的整体生（shēng）活质量，减（jiǎn）少（shǎo）卫生经济负担。

该研（yán）究（jiū）入（rù）组了（le）62例2型糖尿病病人，采用5hmC-Seal技术对血浆（jiāng）cfDNA中（zhōng）表观遗（yí）传（chuán）标志物5hmC的分布情况进行检测，分析5hmC标志物与（yǔ）2型糖尿病血管并发症（zhèng）发生发展（zhǎn）的相关性。结果（guǒ）表明5hmC标（biāo）志物（wù）的变化与T2D合并大血管/微血（xuè）管事（shì）件具有相关性（xìng），主要涉及（jí）一些与血管（guǎn）生物学和糖尿（niào）病（包（bāo）括胰岛素耐受（shòu）和炎（yán）症反应）相关的基（jī）因和信（xìn）号通路。该研究建立（lì）的16个基（jī）因-5hmC标（biāo）志物组合检测可（kě）以（yǐ）准（zhǔn）确区分有并发症和（hé）无（wú）并发症的2型糖尿病病人[实验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于传统临床（chuáng）变量例如（rú）白蛋白尿。除（chú）此之（zhī）外，还建（jiàn）立了（le）13个基因（yīn）-5hmC标志物组合检（jiǎn）测，可以进一步区分T2D合（hé）并单一并发症和多种并发症[实验（yàn）组（zǔ）：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样（yàng）明显优（yōu）于其他传统（tǒng）临床变量。该研究（jiū）得出结论，5hmC标志物反映（yìng）了T2D病人大血管/微血管并发症发生过（guò）程中的（de）表观遗传变化，因而5hmC-Seal检（jiǎn）测（cè）技术（shù）在监（jiān）测糖尿病（bìng）血管并发症发生和进展方面具有良好的临床（chuáng）应用前景。

本研究共（gòng）纳入62例2型糖尿病病人，包括没有血管并发症的病人（rén）12例（lì），有单一血管并发症的病人34例（24例发生（shēng）大血管事件（jiàn），10例发生（shēng）微血管事件），以及有多（duō）种血管并发症的病人16例。试验收集62例病人血（xuè）浆（jiāng），提取cfDNA，利用（yòng）5hmC-Seal技术捕获外周（zhōu）血cfDNA中的5hmC序列，进行二代测（cè）序，通过生物信息学（xué）分析（xī）找出并发症组（zǔ）与无（wú）并发（fā）症组之间有显（xiǎn）著5hmC修饰差异（yì）的基（jī）因，单（dān）一并发症（zhèng）组和多种并（bìng）发（fā）症组之间有（yǒu）显著5hmC修饰差异的基因。随（suí）后利用回归模型对（duì）差异基（jī）因进一步筛选（xuǎn）、优化（huà），弹性网络进（jìn）一步（bù）筛（shāi）选（xuǎn），计（jì）算（suàn）加（jiā）权平均分（fèn），最（zuì）后（hòu）得到一组具有高度灵敏度和特异性的5hmC生物标记（jì）物，并进一步在（zài）实验组中验证（zhèng），分析其（qí）灵敏度和特异性。并将新建立（lì）的5hmC标志物基（jī）因组合的（de）检测（cè）性能与传统（tǒng）临床（chuáng）变量进行对比分（fèn）析。最后对相关基（jī）因进行了信号通路（lù）分析和功能探（tàn）究。

5hmC修饰（shì）水（shuǐ）平与血（xuè）管并发（fā）症（zhèng）具有相（xiàng）关性

利用逻辑（jí）回（huí）归模型对62例有并发（fā）症和无并发（fā）症2型糖尿病（bìng）病人的（de）5hmC差异水平进行分析（xī）发现，有并发症（zhèng）2型糖尿（niào）病病人的622个差异修饰（shì）候（hòu）选（xuǎn）基因（包括上调和下调基因）的归（guī）一化平均数（shù）要明显高（gāo）于（yú）无（wú）并发症的病人（P<0.001），但是单一并（bìng）发症和多发（fā）并发症病人之间没有显（xiǎn）著差异。

之（zhī）后（hòu）将有单一并发症（zhèng）或多种并发（fā）症的50例（lì）病人用逻辑回归模型进行了（le）对比，发现多种并发症的（de）病人的153个差异修饰候（hòu）选基因（包括上调和下调（diào）基因（yīn））的归（guī）一化（huà）平均数要低于无（wú）并（bìng）发症病人（P<0.001）。

5hmC标（biāo）志物可区分有（yǒu）无（wú）并发症（zhèng）患者

62例2型糖尿病病人被随机分成训练组（zǔ）（n=31）和测（cè）试组（n=31）。利用弹性网络筛（shāi）选后发现（xiàn），16基因（yīn）-5hmC标志物（wù）组合检测可以用于区分有并（bìng）发症和无（wú）并发症的2型糖尿病（bìng）病人。

基于16基因组合模型 (Detection Model 1) 的加权平均分分（fèn）析（xī），发现（xiàn）无并（bìng）发症（zhèng）病人的分数在（zài）训练（liàn）集和测（cè）试集中（zhōng）都明显低于有并发症的病人。只考虑（lǜ）加权平（píng）均分的话，受（shòu）试者工作（zuò）特征曲线（ROC）分析表明将cutoff值设置（zhì）成0.5时，在测试（shì）组（zǔ）中中的（de）灵敏度为60%，特（tè）异性为100%。

5hmC标（biāo）志物可区分病人是单一并发症还是多种（zhǒng）并发症

50例有并发症的2型糖尿病（bìng）病人（rén）被随（suí）机分成（chéng）训练组（n=25）和测试组（n=25）。利用弹（dàn）性网络筛选后发现（xiàn），13基因-5hmC标（biāo）志物组（zǔ）合可以区分（fèn）2型糖尿病病（bìng）人是否发生单（dān）一并发症或多种并发症。

基于13基因组合模（mó）型（xíng） (Detection Model 2)， 我们计算了单一（yī）并发症和多种并（bìng）发症的加（jiā）权（quán）平（píng）均（jun1）分，发现在训练集（jí）和测（cè）试集中单一并（bìng）发症和多种并发症病人的分数都有明显差异。值得一（yī）提的是，有肾（shèn）病并发症和无肾病并发症病人的分数（shù）也有明显差（chà）异（yì）。利用加权平均（jun1）分作为判（pàn）断标准的受试者工（gōng）作（zuò）特征曲线（ROC）表明，在测（cè）试组中当将cutoff值设成0.69时（shí），灵敏度为87.5%，特异（yì）性为68.8%。

5hmC标（biāo）志物与传（chuán）统（tǒng）临床变量/危（wēi）险因子的对比

我（wǒ）们评（píng）估了不同临床变量/危险因子用于监测血（xuè）管并（bìng）发症的灵敏（mǐn）度和（hé）特异（yì）性（见表1）。

信号通路分析和功能探究

有（yǒu）并发症和无并发症病（bìng）人（rén）的（de）135个差异候选（xuǎn）基因的（de）功能注释分析表（biǎo）明，这些基因主要富集在一些经典的信（xìn）号通路。错误发现率（lǜ）相关P值位于前10%和基因数目≥3的信号通路包（bāo）括（kuò）由IGF1R, IL-10和FGFR2所介（jiè）导的信号通路。由IGF1R和IL-10介导的信号（hào）通路（lù）与胰岛素抵（dǐ）抗及炎症反应相关，在（zài）血管生物学和（hé）糖尿病（bìng）发生发展过程中发挥重要（yào）作用（yòng）。

Reactome相互作用网络的（de）中心表明，泛素（sù）编码基因（yīn）[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素（sù）A-52亚基核糖（táng）体（tǐ）蛋白融合产物（wù）1(UBA52)]是候选（xuǎn）基因（yīn）（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要连接者（zhě）。在这135个差异候选基因中（zhōng）, 一些基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表（biǎo）现出与糖尿病病程相（xiàng）关的倾向，表明5hmC和糖尿（niào）病血管并发（fā）症之间可能（néng）存在时间依（yī）赖性的相互作（zuò）用（yòng）。基于纵向时间队列的大样本研（yán）究，将可进（jìn）一步明确5hmC变（biàn）化和糖尿病持续时间之间的动态（tài）关联。关于单一（yī）并发（fā）症和多种并发症病人（rén）的159个候选标志基因的（de）功能注（zhù）释研究发现，存在（zài）细胞-细（xì）胞（bāo）连接、胶（jiāo）原蛋白形成、新陈代谢、细胞应激应（yīng）答信（xìn）号（hào）通路的富集，这些信号（hào）通路（lù）均与细胞基本功能密切相关。

血管并发（fā）症（zhèng）是三分之二糖尿病病（bìng）人（rén）的（de）死亡（wáng）原因，若能及（jí）早有效控制血（xuè）管（guǎn）并发（fā）症的发生，将极大（dà）地改善糖尿（niào）病病人的生存质（zhì）量。该研究建立了一（yī）种利用（yòng）cfDNA进行2型糖（táng）尿病血管并发症监测的无创便捷方法，较目前临床（chuáng）标（biāo）志物能更准确地监（jiān）控血管并发症的发生，从（cóng）而提示临床（chuáng）及早采（cǎi）取应对措施，有效（xiào）控（kòng）制病情进展。